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【原文翻译】非洲猪瘟病毒引入饲料场后,饲料生产环境中的分布情

时间:2020-12-30 10:38来源:未知 作者:admin 点击:

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摘要

 

随着非洲猪瘟病毒(ASFV)在全球的传播,有证据表明饲料和/或其成分可能成为病原体传播的潜在载体,了解饲料制造业在这种高致病性病毒的潜在传播方面可能发挥着重要的作用。在堪萨斯州立大学生物安全研究所的生物安全BSL3-Ag动物室中,建造了一个中试规模的饲料厂,包括搅拌机、斗式提升机和相关喷口。在接种ASFV饲料前后,对设备和室内18个不同位置的环境污染进行了评估。首先,通过该系统生产一批饲料,以确认饲料厂为ASFV阴性;然后将接种了ASFV的饲料添加到混合器中,并使用其他未感染的配料进行生产。配料混合后通过斗式提升机排出。随后,又生产了四批不含ASFV的饲料。每批饲料排出后收集环境拭子,其位置分为四个区域:A)饲料接触面,B)非饲料接触面,但距离饲料<3.2英尺,C)非饲料接触面>进料3.2英尺,D)临时表面,如工鞋。在BSL-3实验室环境中用qPCR分析P72型ASFV基因的环境拭子,以检测ASFV特异性DNA。

 

饲料接种ASFV前采集的环境拭子,呈ASFV-DNA阴性。在生产接种了ASFV的饲料后收集的环境拭子显示了A-D区的污染。ASFV-DNA的污染水平报告为每毫升的Ct值或基因拷贝数(CN)。在该装置中,在整个试验过程中,取样区域×批次之间没有相互作用的迹象,取样位置和批次之间的ASFV阳性反应比例没有差异。这表明,一旦ASFV污染进入工厂,污染就会迅速扩散,并持续存在于环境表面,甚至在后续批次的非接种ASFV的饲料生产过程中也是如此。与所有其他表面相比,来自临时表面(D区)的样本检测到更多的ASFV(Ct值较低)(P<0.05),表明ASFV污染水平较高(CN值较高)。与生产后立即采集的ASFV接种批次的饲料相比,生产顺序3后采集的样品检测到的ASFV较少(Ct值较大) (P < 0.05),表明在随后重复的饲料生产过程中,ASFV污染水平较低(CN值较低)。有证据表明,基因拷贝数/mL存在取样区×批交互作用(P=0.002)。对于在生产接种了ASFV的一批饲料后采集的样品,与饲料接触面(A区)相比,从距饲料>3.2英尺的非饲料接触面(C区)采集的拭子的ASFV基因拷贝数/毫升较低(Ct较高)(P<0.05),其他表面(B区和D区)无明显差异。在生产序列1、2和3之后,与其他采样位置相比,从临时表面(D区)采集的样本检测到的ASFV基因拷贝数/mL(低Ct)更多(P<0.05)。在生产序列4之后,没有证据表明在取样位置之间检测到的ASFV基因拷贝数/mL存在差异(P>0.05)。

 

总之,一旦将ASFV通过实验引入到饲料生产环境中,该病毒便在整个设施中广泛分布,并且随着随后一批饲料的产生,其检测率只有很小的变化。

 

引言

 

非洲猪瘟病毒(ASFV)是美国猪肉生产商关注的一个重要问题,由于缺乏疫苗或治疗该病的方法,因此是养猪业的研究重点。北美和南美目前都没有ASFV,但中国及其邻国自2018-2019年以来一直流行该疾病;这使美国担心从这些国家运输的饲料受ASFV污染6。目前,研究已经评估了AFSV在越境运输过程中的存活率7,并确定了在饲料和液体消耗中猪的ASFV感染剂量8。然而,如果引入ASFV,其在饲料生产设施内的分布情况尚不清楚。猪流行性腹泻病毒(PEDV)是唯一一种在饲料生产环境中被广泛研究的病毒。我们之前曾报道过,PEDV能够保留在饲料生产环境中,无论是在饲料还是非饲料表面上,甚至是后续的批次中9。PEDV的其他研究也证明了,一旦病毒进入饲料厂,对设施进行消毒既困难又费力10。总之,这些相同的因素可能会增加来自受污染工厂的饲料和原料的ASFV污染的风险,但据我们所知,目前没有研究证实饲料原料受到ASFV污染的环境风险。因此,本研究的目的是评估使用ASFV污染的饲料对饲料厂环境和后续饲料批次的影响。

 

步骤

 

这项研究是在堪萨斯州曼哈顿的生物安全研究所(BRI)进行的,得到了堪萨斯州立大学机构生物安全委员会的批准(项目批准:1427.1)。工作空间是在BSL-3Ag大型动物房内准备的。研究开始前,按照BRI方案对房间进行清洁和消毒。一批55磅的未感染的猪妊娠期日粮(表1)在一个110磅容量的不锈钢搅拌器(H.C.Davis Sons Manufacturing,型号#SS-L1;Bonner Springs,KS)中混合,通过中试规模斗式提升机输送,并分配到双层袋中。从相对于饲料位置的各个预定位置收集环境拭子(表2)。用第一批不含ASFV的饲料启动系统后,将530毫升亚美尼亚/07非洲猪瘟病毒(1×105 TCID50 mL)与10.5磅饲料在11磅不锈钢混合器中混合,制成11.6磅受污染的接种物,随后添加到44磅饲料中,在一台110磅的不锈钢搅拌机中,进行混合,以制成最终的接种批次的饲料。然后将饲料输送并放入双层袋中。排出接种的饲料批次并收集适当的环境拭子后,使用不含ASFV的饲料混合和排出55磅饲料的过程再重复四次。

 

表1. 日粮组成(以饲料为基础)

 
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1每磅预混料含有33g铁、33g锌、10g锰、5g铜、90mg碘和90mg硒。

2每磅预混料含有750000 mg维生素A、4000 IU维生素E、40mg生物素、180mg维生素B7、400mg叶酸,100000mg胆碱,36mg铬,9000mg左旋肉碱。

3每磅预混料包含750,000 IU维生素A,300,000 IU维生素D3、8,000 IU维生素E,600 mg维生素K3,1,500 mg核黄素,5,000 mg d-泛酸,9,000 mg烟酸,6 mg维生素B12。

4HiPhos 2700(DSM营养产品,Parsippany, NJ)。

5NRC. 2012.《猪的营养要求》,第11版. Natl .Acad.华盛顿特区出版社

 

表2. 环境拭子的位置和按区域分组

 
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环境拭子为0.4×0.4英寸的方形棉纱布,用5 mL PBS预润湿,并在使用前单独储放在50 mL锥形管中。在接种ASFV之前收集的所有拭子PCR均为阴性。在Ct和PCR阳性样品比例分析中,排除阴性对照数据,本研究的主要问题是控制接种后,不同区域和不同批次的饲料对环境表面ASFV检测的影响。数据分析为4×5析因,4个采样面,5批饲料,不包括初始阴性对照样品。从特定批次表面采集的单个样品被视为实验单元。环境拭子用于阴性对照、阳性对照和序列1-4。在ASFV接种饲料前取阴性对照样品,在ASFV接种饲料后取阳性对照样品,阳性对照后每批混匀后采集序列1~4样品。环境取样的地点是根据与饲料的接近程度来选择的(表2)。A区位置为搅拌机带、搅拌机桶、搅拌机卸料、斗式提升机铲斗、斗式提升机皮带和斗式提升机卸料。B区位置为靠近搅拌机的墙壁、靠近斗式提升机的墙壁、靠近搅拌机的地板、靠近斗式提升机的地板和靠近搅拌机的天花板。C区的位置是远离搅拌机的墙壁,远离搅拌机的地板,远离斗式提升机的地板以及远离搅拌机的天花板。D区的位置是研究人员A、B和C的鞋底。为了收集样品,戴上一副干净的一次性手套,并从50 mL锥形管中无菌打开棉纱布。对选定的位置用拭子进行擦拭,将环境拭子放回锥形管中,并更换手套。实验结束后,将环境拭子置于一级容器内,容器进行消毒,然后置于二级容器内,二级容器进行消毒,然后置于三级容器内,表面再次进行消毒,然后运至BSL-3实验室。将多余或未使用的饲料撒在地板上,放水,然后用大量的水冲洗到下水道里。对设备进行拆卸、湿洗,并用Virkon对其表面进行消毒。然后,根据BRI标准操作程序,将房间移交给BRI工作人员进行最终消毒。

 

环境拭子在BRI内的BSL-3实验室处理,加入1-2 mL无菌PBS,室温培养过夜,旋涡振荡,然后直立放置5分钟。回收约1- 2ml,并在-112°F保存,以便稍后进一步处理。然后使用ASFV特异性qPCR方法检测ASFV P72基因,对样品进行qPCR检测。目前的数据不包括病毒传染性的测量。然而,正在进行的调查旨在评估传染性特征。报告的数据包括Ct值和从拭子样本中回收的溶液的基因拷贝数/ml。如果没有发现ASFV DNA,则将样本的Ct值定为45,这是检测的临界值。

 

数据的可视化是在RStudio环境(Version 1.2.1335, RStudio, Inc., Boston, MA)下,使用ggplot2在R编程语言[Version 3.6.1 (2019-07-05), R Core Team, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria]中进行数据可视化。报告ASFV DNA阳性的PCR反应比例如下:(#qPCR阳性反应数/qPCR反应总数)。使用lme4软件包中的glmer函数,采用二项分布来拟合具有可检测ASFV DNA的PCR反应比例,并考虑固定取样区、饲料批次以及相关相互作用,以及环境拭子的随机效应,表明在对环境拭子进行重复qPCR分析的基础上,进行适当水平的实验复制。

 

使用线性混合模型对周期阈值和基因拷贝数/mL数据进行分析,该模型与nlme软件包中的lme函数相匹配,使用类似的固定效应。Ct和基因拷贝数/mL数据的结果报告为最小二乘平均值±平均值的标准误差。未包含可检测ASFV DNA的样品的值指定为45,因为这是在得出样品不含可检测ASFV DNA之前进行qPCR分析的最大周期数。基因拷贝数/mL的分析包括PCR阴性反应,定量基因拷贝数/mL的值为0。所有统计模型均采用视觉评估学生化残差进行评估,并在适当情况下使用解释异质性残差方差的模型。适当时纳入了Tukey多重比较调整。结果在P≤0.05时被认为是显著的,在P>0.05和P≤0.10之间被认为是微显著的。

 

结果与讨论

 

正如预期的那样,在ASFV接种饲料之前,收集的环境拭子中没有通过Ct(图1)或基因拷贝(图2)鉴定出ASFV DNA。在生产接种ASFV的饲料后收集的环境拭子显示所有区域均受到污染,根据接触表面的不同, 38%~100%的qPCR反应可检测到ASFV DNA(表3)。检测ASFV DNA的PCR反应阳性率(P = 0.912)和Ct值(P = 0.519)均不存在采样区×批次饲料交互作用的证据。此外,没有足够的证据得出ASFV-qPCR可检测的反应比例受采样区(P = 0.701)或饲料批次(P = 1.000)影响的结论。这表明,一旦ASFV污染物进入工厂,即使制造了后续的“清洁”饲料批次,污染物也会迅速扩散并持续存在于所有经过测试的环境表面上。

 

图1

 
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使用非洲猪瘟病毒(ASFV)接种猪饲料生产后收集的环境拭子使用ASFV P72编码基因测定的循环阈值。在生产批次2之前,使用批次1灌注饲料制造设备,并以2×103 TCID50 /克接种的饲料接种ASFV。第3批到第6批是系统内制造的饲料的后续批次,最初没有ASFV。A区=与饲料接触的表面;B区=非饲料接触面距饲料接触面<3.2英尺;C区=非饲料接触面>距饲料接触面3.2英尺;D区=临时表面。

 

图2

 
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使用非洲猪瘟病毒(ASFV)接种猪饲料后收集的环境拭子的ASFV P72编码基因分析法测定每毫升基因拷贝数。在生产批次2之前,使用批次1灌注饲料制造设备,并以2×103 TCID50 /克接种的饲料接种ASFV。第3批至第6批是随后在系统内生产的饲料批次,最初不含ASFV。A区=饲料接触面;B区=非饲料接触面距离饲料接触面<3.2英尺;C区=非饲料接触面距离饲料接触面>3.2英尺;D区=临时表面。

 

表3. 在生产经病毒接种的饲料过程中,饲料批次和接触面对检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的交互作用

 
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在最初使用不含ASFV的饲料(阴性)的饲料生产设备启动后,以2×103 TCID50 /克非洲猪瘟病毒(ASFV)接种猪妊娠饲料(阳性)。随后生产了四批饲料(序列1至4),最初没有ASFV。每批饲料之后,在设施内的多个位置收集环境样品,并使用ASFV P72编码基因qPCR分析进行分析。

统计分析包括除阴性对照组外的所有试验组,阴性对照组在接种ASFV之前采集样本,以验证所有设备最初没有ASFV。

采用重复反应法分析每个取样位置和批次的每个取样拭子的可检测ASFV DNA的PCR反应计数/qPCR反应数;区域×批次,P=0.912;区域,P=0.701;批次,P=1.000。

从环境拭子样本中回收每毫升溶液中ASFV P72编码基因的基因组拷贝。分区×批次,P=0.002;分区,P<0.001;批次,P=0.045

在统计分析中,没有检测到ASFV DNA(ND)的样本的循环阈值被分配为45。分区×批次,P=0.519;分区,P<0.0001;批次,P=0.026。

abc 是指在缺乏共同上标的项目中,使用Tukey多重比较调整法得出的差异(P<0.05)。

 

进料批次影响了可检测的ASFV DNA的浓度,与生产ASFV接种的饲料批次后立即收集的样品相比,进料批次序列3后收集的样品具有较低的可检测ASFV(较高的Ct)(表4;P <0.05),所有其他批次的饲料在ASFV接种后收集的样品为两种状态之间。从临时表面(工人靴底)收集的样品的Ct值低于所有其他表面,表明这些表面包含大量可检测的ASFV DNA(P <0.05)。

 

表4. 接种病毒饲料生产中饲料批次和接触面对非洲猪瘟病毒检测的主要影响。

 
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在最初使用不含ASFV的饲料(阴性)的饲料生产设备启动后,以2×103 TCID50 /克非洲猪瘟病毒(ASFV)接种猪妊娠饲料(阳性)。随后生产了四批饲料(序列1至4),最初没有ASFV。每批饲料之后,在设施内的多个位置收集环境样品,并使用ASFV P72编码基因qPCR分析进行分析。

统计分析包括除阴性对照组外的所有试验组,阴性对照组在接种ASFV之前采集样本,以验证所有设备最初没有ASFV。接触面的主要作用值不包括阴性批次的饲料。

通过重复反应分析每个取样位置和批次的每个取样拭子的可检测ASFV DNA的PCR反应计数/qPCR反应数;批次,P=1.000;区域,P=0.701。

在统计分析中,没有检测到ASFV DNA(ND)的样本的循环阈值被分配为45;批次,P=0.026;区域,P<0.0001。

从环境拭子样本中回收每毫升溶液中ASFV P72编码基因的基因拷贝;批次,P=0.045;区域,P<0.001。

abc 是指在缺乏共同上标的项目中,使用Tukey多重比较调整法得出的差异(P<0.05)。

 

基因拷贝数/mL存在取样区×批交互作用(P=0.002)。对于生产接种批次饲料后采集的样本,从C区采集的拭子的基因拷贝数/毫升少于A区(P<0.05),B区为中间区。在接种一批饲料后,D区的基因拷贝数/mL在数值上大于其他表面,但高度的变异性导致在该取样点与其他表面相比没有统计差异的证据。在序列1、2和3之后,与其他采样位置相比,从临时表面采集的样本检测到更多的基因拷贝/mL(P<0.05)。在序列4之后,没有证据表明在取样位置之间检测到的基因拷贝数/mL存在差异(P>0.05)。

 

批次顺序影响基因拷贝数/mL(P=0.045),但使用Tukey多重比较调整来控制I型错误率的平均分离没有导致成对差异的证据(P>0.05)。与临时表面相比,非饲料接触表面(均<3.2英尺和>3.2英尺)的基因拷贝数/mL较少(P<0.05),其中饲料接触表面处于中间。

 

总之,一旦ASFV被引入受控的饲料生产环境中,该病毒便在整个设施中广泛分布。我们观察到,随后生产了无ASFV的饲料批次时,ASFV DNA Ct的量发生了变化,这表明在生产ASFV污染的饲料后的一段时间内,ASFV-DNA在生产表面仍然是可检测到。我们还观察到,ASFV的传播受临时表面的影响很大,这表明人在ASFV的传播中起着巨大的作用。需要完成其他工作,以了解在污染环境中生产的饲料的传染性。

 

本出版物中出现的品牌名称仅供产品识别之用。没有背书的意图,也没有批评暗示类似产品没有提及。使用此类产品的人员应按照制造商当前的标签说明承担使用责任。

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【原文翻译】

中链脂肪酸和单月桂酸甘油酯在液体和饲料中非洲猪瘟病毒的抑制作用

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来源:newprairiepress
文章:Evaluating the Distribution of African Swine Fever Virus Within a Feed Mill Environment Following Manufacture of Inoculated Feed
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