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脂肪酸和单脂肪酸甘油酯对囊膜病毒的灭活及对细胞的杀伤作用

时间:2020-01-15 17:15来源:未知 作者:admin 点击:

 

鲜母乳中的脂质不会灭活病毒,但在4或23摄氏度的温度下储存几天后就会成为抗病毒物质。抗病毒活性的出现取决于奶中的活性脂肪酶,并与奶中的游离脂肪酸的释放有关。一些脂肪酸是乳脂类的正常组成部分,我们测试了它们对包膜病毒的抵抗能力,即水泡性口炎病毒、单纯疱疹病毒和绵羊髓鞘脱落病毒,以及非包膜病毒脊髓灰质炎病毒。短链和长链饱和脂肪酸在测试的最高浓度下没有或只有很小的抗病毒作用。另一方面,中链饱和脂肪酸和长链不饱和脂肪酸对囊膜病毒都是高度活性的,尽管最大程度上病毒灭活所需的脂肪酸浓度变化多达20倍。这些脂肪酸的单脂肪酸甘油酯也具有高度的抗病毒作用,在某些情况下,其所需浓度比游离脂肪酸低10倍。没有一种脂肪酸能灭活脊髓灰质炎病毒。抗病毒脂肪酸被发现影响病毒囊膜,导致其渗漏,在较高浓度下,囊膜和病毒颗粒完全解体。它们还导致组织培养细胞的质膜解体,导致细胞裂解和死亡。同样的现象也发生在储存抗病毒母乳的细胞培养中。因此,母乳脂质在体外抗菌作用很可能是由于脂肪酸分解细胞膜和病毒膜引起的。需要进行研究,以确定母乳脂质是否在婴儿胃肠道中具有抗菌作用,并确定它们在保护婴儿免受胃肠道感染方面发挥了什么作用(如果有的话)。

 

母乳含有许多非免疫球蛋白的抗病毒因子(5、6、13、17)。这些因素中的一些位于母乳的非脂部分,但大多数研究发现抗病毒活性与脂质部分有关。Welsh等人(21)发现脂类抗病毒的特性好,奶中的游离不饱和脂肪酸和单脂肪酸甘油酯灭活了囊膜病毒,而不是非囊膜病毒。在最近的一项研究(9a)中,我们确认并扩展了Welsh等人的工作。我们发现,新鲜母乳中的脂类并不是抗病毒的,但在4°C下储存和婴儿胃中时,可能通过奶中的甘油三酯中释放脂肪酸而对囊膜病毒具有活性。在本研究中,我们比较了脂肪酸和单脂肪酸甘油酯对囊膜病毒的影响,并证明了不饱和脂肪酸会破坏囊膜和细胞膜。

 

 

 

材料和方法

细胞培养

Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系;Flow Laboratories Inc.,McLean,Va.)在Eagle基础培养基(BME)(GIBCO 实验室,Grand Island,N.Y.)中用10%灭活胎牛血清(GIBCO)培养。绵羊成纤维细胞培养物是取自羊脑脉络丛,在BME中用15%的羊血(科罗拉多血清公司)培养。Vero细胞的维持培养基为含2%胎牛血清的BME;绵羊细胞的维持培养基为含2%羔羊血清的BME。所有培养基中均加入庆大霉素(0.1%)。

 

病毒

水泡性口炎病毒Indiana株(VSV)和单纯疱疹病毒1型MacIntyre株(HSV-1)是从美国马里兰州罗克维尔的美国型培养物收集处获得的,在Vero细胞中生长。Visna病毒K796(19)株在绵羊脉络丛细胞中培养。脊髓灰质炎病毒1型Chat株是从纽约州基础研究所的鲤鱼体内获得的,在Vero细胞中生长。

 

病毒滴定法

采用10倍稀释液(VSV、脊髓灰质炎病毒和HSV-1接种到Vero细胞培养液中,visna病毒接种到绵羊脉络丛细胞培养液中)在96孔微量组织培养板(Becton Dickinson Labware, Oxnard, Calif.)中进行病毒滴定。在维持培养基中接种病毒稀释液(0.1 ml),每个稀释液接种四个孔。根据病毒的不同,培养皿保存2-12天,每天检查细胞病变情况。用Reed和Muench(14)法计算病毒滴度。

 

母乳样本

在产后1至5个月的无菌条件下收集母乳样本1、2和3,并在-86℃下深冷冻,直到用于实验。

 

试剂

脂肪酸和单脂肪酸甘油酯购自Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.(最纯级)。在使用前立即用10%胎牛血清在BME中以最高流速旋转1分钟,以液体形式熔化和乳化。将乳剂(100 mg/ml)在维持培养基中稀释至所需浓度。短链脂肪酸通过添加1 M NaOH中和至pH 7。不饱和脂肪酸和单脂肪酸甘油酯在氮气下保存,并在制备后几分钟内使用乳液。实验前将硫酸艾司碱(physostigmine;Sigma)和NaCl溶于水并在维持培养基中稀释 

 

抗病毒活性测定。

约105 的50%的组织培养感染剂量(TCID50s)的病毒与5倍稀释的母乳或脂肪酸和单脂肪酸甘油酯混合在维持培养基中,在37℃下培养30分钟。将病毒单独与维持培养基混合作为对照。培养后,用连续稀释终点法测定每种混合物的感染性。在维持培养基中稀释(10倍)。将10-2至10-5稀释液接种到Vero细胞单层中,并按上述方法测定病毒滴度。对照病毒滴度(log10)与乳-病毒和脂-病毒混合液滴度的差异,即病毒滴度的降低,被用作抗病毒活性的测定。

 

电子显微镜下病毒的制备。

VSV在Beckman L2-65B超离心机中经差速离心浓缩和部分纯化,并将样品(1010TCID50/ml)在37℃下与含或不含乳化脂肪酸的维持培养基中培养30min。将病毒悬浮液涂在碳涂层网格上,用2%磷钨酸(pH7.0)进行负染。用日立HS 8-2电子显微镜在50kv下对标本进行检查

 

电子显微镜用细胞的制备。

细胞单层培养物在37℃单独或与母乳或脂肪酸乳剂一起培养30分钟。然后用Hanks平衡盐溶液仔细冲洗细胞层,并用2%戊二醛固定在0.1m的cacodylate缓冲液中。在缓冲液中漂洗并用2%的四氧化锇固定后,通过乙醇分级脱水、临界点干燥,并涂覆10.5纳米金的溅射物脱水细胞。在20千伏的ISI-SS40扫描电子显微镜下检查。

 

游离脂肪酸水平的估计。

用0.5ml氯仿甲醇(2:1)从100μl牛奶样品中提取脂质。去除上相,并在硅胶G(Merck&Co.,Inc.,Rahway,N.J.)板上用油酸的定量标准在正己烷-二乙基醚乙酸(70:30:1.5)组成的溶剂系统中用薄层色谱法分离出一小份氯仿层。显影板经重铬酸-硫酸喷涂后进行炭化,用密度法测定游离脂肪酸含量。

 

 

 

结 果

脂肪分解与抗病毒活性的关系。

先前的结果(9a)表明,母乳在4℃、23℃或-20℃下储存不同时间后,对包膜病毒具有活性。抗病毒活性与乳脂部分有关,但脱脂部分才能成为抗病毒物质。为了测试抗病毒活性的出现是否依赖于活性乳脂酶,我们将牛奶样品1、2和3在4°C下储存4天,其中加入或不加入两种脂肪酶抑制剂,即5 mM eserine sulfate和1M NaCl(7、8)。病毒滴度(VSV)从105下降到C10-5 TCID50,与不含抑制剂的母乳培养后,显示减少了103.5 TCID50。与此相反,以同样的方式与储存有脂肪酶抑制剂的母乳培养的病毒在所用浓度下没有感染性损失。这些抑制剂对已经抗病毒的牛奶没有影响。

 

另一个迹象表明,储存母乳中抗病毒活性的出现与脂肪分解有关,如表1所示。深度冷冻的母乳样品1的游离脂肪酸含量未检测到,但在4℃和23℃下储存4天后,游离脂肪酸的含量分别增加到7和12 mg/ml。两个储存的样本都是高度抗病毒的。另一方面,母乳样品3的游离脂肪酸含量在储存后仅增加到2mg/ml,而且母乳没有抗病毒作用。与牛奶样品3相比,牛奶样品1的脂蛋白脂酶水平要高得多,这与牛奶抗病毒活性(9,9a)的出现有关。

 

表1. 母乳a的游离脂肪酸(FFA)及其抗病毒活性

同样的结果也适用于新鲜牛奶或在-86℃下储存的牛奶

 

脂肪酸和单脂肪酸甘油酯的抗病毒活性。

母乳(11)中发现的一些脂肪酸的抗病毒活性比较如表2所示。短链(丁酸、己酸和辛酸)和长链饱和(棕榈酸和硬脂酸)脂肪酸在测试的最高浓度下没有或只有很小的抗病毒作用。另一方面,中链饱和脂肪酸和长链不饱和脂肪酸均具有抗病毒作用,但浓度不同。表2显示了导致VSV滴度降低10000倍以上的最低浓度。浓度降低2倍不能使病毒灭活,只能使滴度降低10倍。HSV-1和visna病毒(一种逆转录病毒)也得到了类似的结果。与之相反,脊髓灰质炎病毒在37℃下与浓度为8 mg/ml的癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸培养30分钟,与未经脂肪酸培养的脊髓灰质炎病毒滴度(104.7 TCID50)相比,病毒滴度没有显著降低。油酸和亚油酸钠盐具有与游离酸类似的抗病毒作用。

  

表2. 脂肪酸37℃培养30min灭活病毒

病毒混合物中脂肪酸的浓度在37℃培养30分钟。所有脂肪酸均以两倍浓度进行测试。显示的是降低VSV滴度≥4.0 log10单位的最低浓度或测试的最高浓度(丁酸、己酸、辛酸、棕榈酸和硬脂酸)。

b VV,Visna病毒。

c 碳原子:双键

d ND,未进行测试

e 对照病毒在维持培养基中的滴度(log10)为5.5,而在脂肪酸病毒混合物的10-2至10-5稀释液中未检测到病毒。在低稀释度(10-1或未稀释)下测试这些混合物是不可能的,因为它们对细胞培养物是有毒的。假设10-1稀释液含有传染性病毒,脂肪酸病毒混合物的最高可能滴度为101.5 TCID50,病毒滴度的降低(log10)将等于4.0(5.5减1.5)。如果混合物的滴定度小于101.5,则滴定度的降低将大于4.0

 

脂肪分解的其他产物,如α-单脂肪酸甘油酯,也进行了抗病毒活性试验(表3)。除单肉豆寇酸甘油酯和单油酸甘油酯外,所有被测的α-单脂肪酸甘油酯的浓度都比相应脂肪酸的浓度低5到10倍(毫摩尔)。

 

表3. α-单脂肪酸甘油酯37℃培养30min灭活病毒

最低浓度导致病毒滴度降低3.0 log10

b 碳原子:双键

c ND, 未进行测试

d 测试浓度的最高抗病毒活性(0.5至4 mg/ml)。在加入病毒前,将单脂肪酸甘油酯溶解在乙醇中,并在维持培养基中稀释1:100,得到同样的结果。

  

脂肪酸对病毒颗粒的影响。

为了研究脂肪酸对病毒颗粒的影响,将VSV浓缩、部分纯化,然后在37℃下,添加或不添加亚油酸的维持培养基中培养30min。在不添加脂肪酸的情况下,培养的病毒,在负染色法下显示大量特征性的子弹状颗粒,其表面覆盖有尖刺,并含有螺旋状核衣壳(图1a)。与每毫升0.5毫克亚油酸培养会导致病毒囊膜渗漏,使染色剂进入颗粒(图1b)。这种效果在每毫升中加入1毫克亚油酸时更为明显(图1c),导致颗粒崩解。电子显微镜用样品的滴定表明,每毫升0.5毫克亚油酸可使病毒滴度降低10倍,而每毫升1毫克亚油酸可使病毒滴度降低1000倍以上。用低浓度花生四烯酸培养的VSV进行负染色也得到了类似的结果。

 

图1。显示亚油酸作用的VSV颗粒的负染色。VSV在37℃下在(a)维持培养基,(b)亚油酸(0.5 mg/ml维持培养基)和(C)亚油酸(1 mg/ml维持培养基)中培养30分钟。(a) 正常的完整颗粒覆盖着尖刺。(b) 病毒囊膜不再完整,允许污渍渗透到大多数颗粒中。(c) 病毒颗粒处于不同的解体阶段。Bar=0.1μm。

 

脂肪酸分解细胞膜

脂肪酸处理过的VSV的负染色表明,病毒失活是由病毒膜破裂引起的。为了研究对细胞膜的影响,将Vero细胞或绵羊成纤维细胞单层置于37℃下培养30min,加入或不加入1 mg亚油酸/ml,并用扫描电镜观察。在不含脂肪酸的培养基中培养的对照细胞显示完整的细胞膜(图2c),而在每毫升1毫克亚油酸处理的细胞层中,细胞膜部分或完全分解(图2d),导致细胞溶解。将细胞与在4°C下储存4天的母乳一起培养,也可以看到同样的效果(图2b)。该母乳样品(1号)(表1)每毫升含有7毫克脂肪酸,具有高度抗病毒作用。另一方面,母乳样品1在-86℃下保存4天(表1)对细胞膜没有影响(图2a)。

图2。细胞培养的扫描电子显微照片,显示母乳和亚油酸的作用。Vero细胞在37℃下在(a)人乳中培养30分钟,(b)在4℃下储存4天的母乳,(C)维持培养基或(d)亚油酸(1 mg/ml 维持培养基)。母乳样品在维持营养基中按1:5稀释。(a和c)有微绒毛的完整细胞膜。(b和d)细胞膜部分或完全解体。Bar=1.0μm。

 

 

 

讨 论

我们已经证明(9a)母乳不仅在储存时具有抗病毒作用,而且在婴儿喂养后1小时内也具有抗病毒作用。贮藏母乳中抗病毒活性的出现与乳汁中脂蛋白脂肪酶的水平有关,表明其是由脂肪酸或其它脂质水解产物的释放引起的。Welsh等人以前也报道过类似的结果。(20,21)。在这项研究中,我们提供了更多的数据,表明储存的母乳的抗病毒作用是由脂肪分解引起的,并且表明在母乳中最常见的9种脂肪酸中(11),有7种在杀死包膜病毒方面非常活跃。多不饱和长链脂肪酸活性最强,而中链饱和脂肪酸,特别是月桂酸和肉豆蔻酸也表现出活性。单葵酸甘油酯和单月桂酸甘油酯也表现出活性,但比相应的游离酸所需浓度低10倍,豆蔻酸甘油酯的活性一直较低。长链饱和脂肪酸(约占母乳脂肪酸的30%)和短链脂肪酸(更常见于牛奶)(11)没有或者说是很轻微的抗病毒作用。在体外发现的能使病毒滴度降低10000倍的脂肪酸浓度(表2)与母乳中发现的脂肪酸浓度范围相同(11)。我们的结果表明,随着母乳中的甘油三酯的脂解过程,无论是在储存过程中还是在胃肠道中,都会产生两种类型的抗病毒脂质,单脂肪酸甘油酯和游离脂肪酸。这两类脂质对肠道病原体的作用可能不同。这也可能适用于每个脂质类的成员。

 

我们的研究结果与先前对不同病毒(6、10、16、20)的研究结果相似,进一步证实了乳液中大多数脂肪酸的显著抗病毒作用。电镜研究表明,抗病毒作用主要是由脂肪酸分解病毒包膜引起的。Sarkar等人也报告了类似的发现。(17),他用母乳的乳脂部分治疗小鼠乳腺肿瘤病毒,并注意到病毒囊膜的降解。我们的研究还显示了脂肪酸浓度和储存的灭活囊膜病毒的母乳对培养细胞质膜的破坏。我们发现具有强烈抗病毒作用的脂肪酸和单脂肪酸甘油酯可诱导细胞膜融合(1)。虽然确切的机制尚不清楚,但有人认为脂肪酸及其单脂肪酸甘油酯被结合到脂膜中,导致双层膜的不稳定(3)。类似的机制可能导致我们观察到的细胞膜和病毒包膜的完全解体。我们没有比较不同脂肪酸浓度下细胞和囊膜病毒的敏感性。然而,一项使用疏水醇的研究表明,病毒的杀灭浓度显然对培养细胞没有影响(18)

 

有几项研究表明,母乳喂养的婴儿与奶瓶喂养的婴儿相比,感染的发生率较低,尤其是胃肠道感染(4,12)。然而,尽管脂肪酸及其衍生物在体外具有众所周知的抗菌作用,但它们在预防婴儿疾病方面的作用尚未确定。尽管大多数已知的胃肠道病毒是非囊膜的,但婴儿坏死性小肠结肠炎是由囊膜病毒引起的,即人类肠道冠状病毒(15)。蓝氏贾第鞭毛虫是一种感染儿童的肠道原生动物寄生虫,在体外被脂肪酸杀死(9),这表明脂肪酸可能在肠道中产生贾第鞭毛虫效应。由于脂肪酸通过破坏细胞的质膜来溶解细胞,所以它们很可能不仅杀死贾第虫,还杀死其他寄生原生动物。虽然有一些研究已经证明母乳喂养后人和动物胃内容物具有抗菌活性(2,9a),但还需要更多的工作来确定这些活性因子的特性,并确定它们在预防和恢复胃肠道感染方面的作用。


译自:Inactivation of Enveloped Viruses and Killing of Cells by Fatty Acids and Monoglycerides
作者:Halldor Thormar;  Charles E. IsaacsH.R. Brown;  M.R.Barshatzky

来源:ResearchGate
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