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7种α-单脂肪酸甘油酯对食源性致病菌和腐败菌的抗菌作用比较

时间:2020-01-15 17:24来源:未知 作者:admin 点击:

摘要

 

本研究的目的是在相同的体外条件下,比较7种中链的α-单脂肪酸甘油酯(MAG)对10种革兰氏阳性和革兰氏阴性的食源性致病菌(蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、肠沙门氏菌、铜绿假单胞菌)的抑制作用及其生长情况。在251500mg·l-1浓度范围内,观察了MAG(单辛酸甘油酯、单葵酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单肉豆寇酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯、十一酰基-单脂肪酸甘油酯和十一烯酸甘油酯)的抑制作用。用细菌的光密度法研究细菌在MAG24小时内的生长情况,用Gompertz方程和滞后时间进行建模,得出了最大比生长速率和最大值。中链的MAG主要抑制革兰氏阳性菌的生长,表现为滞后时间延长、比生长速率降低和细胞密度降低。从最低抑菌浓度的角度对被测的MAG的抑菌效果进行排序:MAG-C12:0>MAG-C11:0>MAG-C10:0>MAG-C14:0>MAG-C11:1>MAG-C8:0>MAG-C16:0。在体外,除了最高浓度外,被测的α-单脂肪酸甘油酯对革兰氏阴性菌的生长没有明显的抑制作用。本研究的主要贡献是比较几种中链的MAG在相同条件下对细菌生长的影响。

 

关键字

 

抑制效果,α-单脂肪酸甘油酯,微生物,Gompertz模型,比生长速率,滞后时间。

 

材料和方法
 

在食品中,可能会大量繁殖可传播给人类的食源性病原体、动物病原体或腐败微生物。动物产品的表面和内部微生物的不良生长可能危害健康。因此,食品及其成分的保存已成为当今的一个重要问题。在食品加工业中,抗菌物质属于最重要的添加剂类别(Davidson and Branen 2005Kačniovčet al2009年)。抗菌物质应该是食品不可分割的一部分,甚至可以改善其功能特性。这些物质包括单脂肪酸甘油脂(MAG)(KabaraMarshall2005年),它们用于食品加工行业的乳化能力(MoonenBas2004年)。此外,它们还可以改善许多食品的流变特性,例如乳制品或烘焙制品(Ravi等人。2000年;Buňka等人。2007年)。

 

脂肪酸和单脂肪酸甘油酯的抗菌活性及其他功能特性取决于碳原子的数量和脂肪酸链中双键的存在。ThormarHilmarsson2007)。在某些条件下,单脂肪酸甘油酯可以抑制病原菌、病毒(Thormar和Hilmarsson,2007年)、孢子形成菌(Mansour等人,1999年;Skrivanova等人,2006年)或酵母菌的生长。(Bergsson等人。2001年)。然而,食物成分会影响单脂肪酸甘油酯和脂肪酸的抑制作用。某些食品物质(如淀粉、血清白蛋白、磷脂、胆固醇)能与这些分子发生反应,从而降低它们对有害微生物的抑制作用。此外,在一些食品中,使用一些α-单脂肪酸甘油酯可能不合适,因为它们的感官特性可能发生负面变化(DavidsonBranen 2005Buňka等人。2007年)。

 

脂肪酸和单脂肪酸甘油酯是亲脂物质,因此它们攻击的目标是细胞的细胞质膜。尽管脂肪酸及其衍生物的抗菌机理尚未完全被认识,但人们发现它们会对用作渗透屏障的细胞膜造成损害,并抑制氨基酸向细胞的转运Dufour等人。2007年;ThormarHilmarsson2007年)。另一种假说,短链和中链脂肪酸以非解离形式渗透到细菌细胞中,并在细胞内解离,从而导致细胞内容物酸化(Sado Kamdem等人。2008年)。细胞内pH值降低可导致细胞内酶失活(Nair等。2005年)。有机酸(TokarskyyMarshall 2008)或螯合剂(BranenDavidson 2004)可增加单脂肪酸甘油酯的抑制作用。

 

许多研究都是针对单个MAG的抗菌作用进行的,但是,在相同条件下,几种含MAG对细菌生长指标影响的研究较少。因此,本研究的目的是比较7α-单脂肪酸甘油酯对革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌的致病微生物和和参与食品腐败的微生物的抑制作用。为此,我们选择了一组含有中链脂肪酸(单辛酸甘油酯、单葵酸甘油酯、单月桂酸甘油酯、单肉豆寇酸甘油酯、单棕榈酸甘油酯)和碳数为奇数的不太常见脂肪酸(十一酰基-单脂肪酸甘油酯和十一烯酸甘油酯)。这些单脂肪酸甘油酯可以用作食品加工工业的添加剂。

 

材料和方法

 

所选的α-单脂肪酸甘油酯对以下革兰氏阳性菌进行了抑菌试验:蜡样芽孢杆菌CCM 2010,枯草芽孢杆菌亚种。弗氏柠檬酸杆菌4062,粪肠球菌CCM 4224,黄体微球菌CCM 732,金黄色葡萄球菌亚种。金黄色葡萄球菌CCM 3953和革兰氏阴性菌:弗氏柠檬酸杆菌CCM 7187,大肠杆菌CCM 3954,奇异变形杆菌CCM 7188,铜绿假单胞菌CCM 3955,肠炎沙门氏菌CCM 4420。所有使用的细菌都是从捷克微生物收集中心(CCM)获得的。

 

10ml营养肉汤No 2OxoidBasingstokeUK)接种于25μl相应的细菌接种液中,制备细菌悬浮液。细菌随后在30±1°C的温度下生长24小时。

 

解决方案和化学物质

根据Janišet al.的方法,在铬离子的催化作用下,向缩水甘油酯中添加适当的脂肪酸,制备单脂肪酸甘油酯。(2000年)。所用的化学物质来自Sigma-Aldrich公司。(美国圣路易斯)。制备了以下α-单脂肪酸甘油酯:单辛酸甘油酯(MAG-C8:0)、单葵酸甘油酯(MAG-C10:0)、十一烯酸甘油酯(MAG-C11:0)、十一酰基-单脂肪酸甘油酯(MAG-C11:1)、单月桂酸甘油酯(MAG-C12:0)、单肉豆寇酸甘油酯、(MAG-C14:0)和单棕榈酸甘油酯(MAG-C16:0)。用乙醇三重结晶法纯化产物。用高效液相色谱法测定,所用MAGs纯度均优于99%。用原子吸收光谱法测定,以CrIII)计的催化剂残留量小于20 mg·kg-1

 

25 g·l-1w/v)的浓度在无水乙醇(LachNer, Neratovice, Czech Republic)中制备所测α-单脂肪酸甘油酯的储备溶液(100 ml)。此后,通过过滤(微孔孔隙率为0.22μm)对储备溶液进行消毒,并在4°C的温度下储存在密闭试管中。

 

α-单脂肪酸甘油酯对细胞生长影响的观察

将含或不含单脂肪酸甘油酯的250μl培养基(Mueller Hinton BrothHiMediaBombaiIndia)加入微孔板中,24-h细菌悬液1.9-8.6×104CFU·ml-1的细菌密度稀释,取5μl 加入微孔板中。在所有情况下,在以下浓度的MAGs下观察细胞的生长:255010025050010001500 mg·l-1w/v)。高压灭菌前,使用1 mol·l-1 NaOHHCl将培养基(含或不含单脂肪酸甘油酯)的pH值调整为6.70–6.80。以不含相应单脂肪酸甘油酯的250μl培养基和5μl菌悬液的培养井为阳性对照。以含有255μl肉汤的未接种板作为阴性对照。在所有浓度的MAGs(包括对照组)中,在至少5个微孔板中观察到生长。以乙醇为溶剂,在7%v/v)浓度范围内对MAG的抑制作用进行了研究。

 

TECAN-Sunrise-TW/TC仪器(Austria TECAN)分光光度法观察了25±1°C(选择的温度与室温相对应)下的细菌生长。利用细胞悬液的光密度(OD)值观察细菌生长24小时。在600nm波长下每隔30分钟测定细菌的生长。每次测量前,将样品摇晃10 s。每项试验一式三份。

 

为了排除乙醇(MAG的溶剂)的抑制作用,在本研究之前进行了实验。在培养基中加入适量无水乙醇(不含MAG)。结果表明,乙醇浓度(<7%v/v)对所选细菌的生长没有影响。

 

数据分析

按一定的生长指标,测定了一定浓度的α-单脂肪酸甘油酯对微生物的影响:滞后时间(λ)、A值和最大比生长速率(μm)。在一定浓度下,将给定MAG的指标A(达到的最大值)与阳性对照的A值(没有MAG的生长的值)的相对表达式进行比较。在此基础上,计算了时间t[y=lnODt/OD0]中相对OD值的对数。利用三参数Gompertz模型描述了相对OD值(y)的对数与栽培时间(t)的关系:

 

 

其中:μm是最大比生长速率(h- 1);λ是滞后时间;A是渐近值[a= LnODω/OD0],定义为达到最大值(ZwiteTein等)。1990年)。在μm>0λ>0A>0的条件下,通过非线性回归分析(非线性最小二乘回归)确定μmλA参数的估计值。采用Marquardt-Levenburg方法是通过Unistat®5.5软件(Unistat Ltd., London, UK)应用的。在估计参数中加入了标准差。用相关系数(r)评价所设计模型的质量。对数相对OD值(y)与培养时间(t)的模型相关系数(r)在0.890.99的区间内,用Unistat®5.5软件中的三方方差分析(ANOVA)对单脂肪酸甘油酯在各浓度下的ef效率进行总体比较。

 
 

 结果
 

 

革兰氏阳性菌

在较高浓度(10001500 mg·l-1)的单辛酸甘油酯(MAG-C8:0)存在下,培养24小时后,革兰氏阳性菌没有生长(以OD增加来衡量)。在大多数被检测的革兰氏阳性细菌中,即使在单棕榈酸甘油酯(MAG-C16:0)最高浓度,也没有检测到它们的生长受到完全抑制。图12和表1显示,随着MAG-C8:0MAG-C16:0浓度的增加,被测革兰阳性菌的相对A值和比生长速率逐渐降低,同时出现时滞延长。

 

单葵酸甘油酯(MAG-C10:0)对检测的革兰氏阳性菌的影响低于低于MAG-C8:0MAG-C16:0。在浓度50-500 mg·l-1的范围内使用MAG-C10:0可抑制革兰氏阳性菌的生长(表1,图1和图2)。

 

单月桂酸甘油酯(MAG-C12:0)对革兰氏阳性菌株的抑制效果最好。在蜡样芽胞杆菌CCM 2010、枯草芽胞杆菌CCM 4062和藤黄微球菌CCM 732中,施用最低浓度的MAG-C12:025 mg·l-1)后检测到总生长抑制。在粪肠球菌CCM 4224和金黄色葡萄球菌CCM 3953,分别在100mg·l-1250mg·l-1浓度下用MAG-C12:0后出现生长抑制。

 

以最低浓度的单肉豆寇酸甘油酯(MAG-C14:0)为对照,观察了其对藤黄微球菌CCM 732生长的抑制作用。在25-100 mg·l-1浓度的MAG-C14:0存在下培养期间,芽孢杆菌属的细菌对对照组表现出显著的延迟时间延长和比生长率降低(图12;表1)。

 

25-250 mg·l-1浓度下,添加十一烯酸甘油酯(MAG-C11:0)后,革兰氏阳性菌生长受到抑制。革兰氏阳性菌必须适应MAG-C11:0的存在更长的时间,这一点从滞后时间段可以清楚地看出(表1)。从图1和图2可以清楚地看出,施用较低浓度的MAG-C11:0后,与对照相比,相对a值降低,比生长率降低。在十一酰基-单脂肪酸甘油酯(MAG-C11:1)中,较高浓度的MAG对细菌生长有抑制作用。这个MAG似乎是第三个最不有效的MAG(在MAG-C16:0MAG-C8:0之后)。

 

表1。用Gompertz模型计算了在α-单脂肪酸甘油酯(MAG-C8:0、MAG-C10:0、MAG-C11:0、MAG-C11:1、MAG-C12:0、MAG-C14:0和MAG-C16:0)存在下培养的革兰氏阳性菌在25-1500mg·l-1浓度范围内的滞后时间λ(h)

 

 

显示滞后时间值±标准偏差。**对照样品(接种微生物但不接种α-单脂肪酸甘油酯)的滞后时间,N-无生长

 

 

 图1。在浓度为25~1500 mg·L-1的1-单甘油酯(MAGC8:0,MAG-C10:0,MAG-C11:0,MAG-C11-1,MAG-C12:0,MAG-C14:0,MAG-C16:0)培养的5种革兰氏阳性菌中,A值(GoPurz模型估计的最大值)。A–蜡样芽孢杆菌CCM 2010;B–枯草芽孢杆菌CCM 4062;C–粪肠球菌CCM 4224;D–藤黄微球菌CCM 732;E–金黄色葡萄球菌CCM 3953。A值与对照样品(接种微生物但不接种α-单脂肪酸甘油酯)相对表达。误差条显示标准偏差

 

 

 

图2。在25–1500 mg·l-1浓度下,在α-单脂肪酸甘油酯(MAG-C8:0、MAG-C10:0、MAG-C11:0、MAG-C11:1、MAG-C12:0、MAG-C14:0和MAG-C16:0)存在下培养的5种受试革兰阳性菌的比生长率μm(h-1)(通过Gompertz模型估算)。A–蜡样芽孢杆菌CCM 2010;B–枯草芽孢杆菌CCM 4062;C–粪肠球菌CCM 4224;D–藤黄微球菌CCM 732;E–金黄色葡萄球菌CCM 3953。误差条显示标准偏差

 

革兰氏阴性菌

在α-单脂肪酸甘油酯中,浓度为1500mg·l-1MAG-C10:0对革兰氏阴性菌的生长抑制作用最强。在这种α-单脂肪酸甘油酯中,除了奇异变形杆菌CCM 7188外,未检测到革兰氏阴性菌的生长。在试验浓度较低(<1500 mg·l-1)的范围内,观察到试验革兰氏阴性菌的相对a值(图3)和比生长率以及滞后时间延长(未显示数据)的下降。

 

MAG-C8:0添加到浓度≥500mg·l-1的培养基中后,显著降低大肠杆菌CCM 3954、肠炎沙门氏菌CCM4420弗氏柠檬酸杆菌CCM 7187的生长(图3)。

 

 

图3。在浓度为25~1500 mg·L-1的1-单脂肪酸甘油酯(MAGC8:0,MAG-C10:0,MAG-C11:0,MAG-C11-1,MAG-C12:0,MAG-C14:0,MAG-C16:0)培养下的5种革兰氏阴性菌的A值(Gompertz模型估计的最大值)。A–弗氏柠檬酸杆菌CCM 7187;B–大肠杆菌CCM 3954;C–肠炎沙门氏菌CCM 4420;D–铜绿假单胞菌CCM 3955;E–奇异变形杆菌CCM 7188。A值与对照样品(接种微生物但不接种1-单脂肪酸甘油酯)相对表达。误差条显示标准偏差。

 

在α-单脂肪酸甘油酯(如MAG-C11:0MAG-C11:1MAG-C12:0MAG-C14:0MAG-C16:0)存在下,通常仅在浓度≥1000 mg·l-1时才检测到革兰氏细菌的生长特性显著下降(图3)。

 

革兰阳性和革兰阴性菌的抗菌作用

 应用MAG后,革兰氏阳性菌组的比生长速率μm显著降低(P0.001),最大革兰氏阳性率(G0.001)与革兰氏阴性菌组相比有显著性差异(P0.01)。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌之间的滞后时间λ差异未被证实(P0.05)。三种方差分析表明,两组细菌的MAG差异均有显著性(P0.05);随着MAG浓度的增加,最大A值显著降低(P0.001),滞后时间λ延长(P0.001);MAG浓度的增加使最大比生长速率μm降低(P0.05)。
 

讨论 

 

单辛酸甘油酯(MAG-C8:0)对细菌的抑菌作用较弱。Nair等人(2005)观察了MAG-C8:0对引起肉牛乳腺炎的链球菌和葡萄球菌的影响,发现该MAG5460-10915mg·l-1浓度范围内可显著减少细胞数量。此外,较高浓度(10915 mg·l-1)的MAG-C8:0对污染肉制品的单核细胞增生李斯特菌也有抑制作用(Garcia等人。2007年)。

 

Růžička等人(2003)发现与我们的研究相比,MAG-C10:0对葡萄球菌的抑制浓度较低(150mg·l-1)。另一方面,MAG-C10:0在粪肠球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度与本研究相同。

 

在本研究中,铜绿假单胞菌CCM 3955是所有在MAG检测试验中最敏感的革兰氏阴性菌。这是一项新发现,因为许多假单胞菌属的细菌通常被认为对不利的环境条件具有抵抗力Růžička等人(2003)未发现MAG-C10:01000mg·l-1MAG-C12:0500mg·l-1对铜绿假单胞菌有任何抗菌作用。类似地,BranenDavidson2004)在MAG-C12:0浓度为250 mg·l-1时,没有检测到荧光假单胞菌生长的有抑制作用。所引用的任何著作中都没有提到所使用的较高浓度的MAG。然而,我们的研究结果表明,较高浓度的MAG-C10:0和MAG-C12:0都可以完全抑制铜绿假单胞菌的生长。在24小时内,上述两种较低浓度的MAG会导致假单胞菌生长放缓

 

我们的结果与其他作者一致,没有发现单脂肪酸甘油酯对肠道细菌有更显著的抑制作用。Růžička等人(2003)未检测到MAG-C12:0对大肠杆菌或肺炎克雷伯菌的抑制作用。未观察到同一MAG对沙门氏菌、大肠杆菌和克雷伯氏菌的抑制作用(McLay等人。2002年;Marounek等人。2003年;Preuss等人。2005年;Skrivanova等人。2006年)。通过其他因素,例如降低环境的pH值,可以增强α-单脂肪酸甘油酯对肠杆菌的抗菌作用(Sado Kamdem等人。2008)或通过向培养基中添加其它抑制剂,例如丁香酚(Brasyyk和霍利1998)、乙二胺四乙酸(Branen和戴维森2004)或乳过氧化物酶系统(Mulle等)。2002年)。

 

 MAG-C12:0对革兰氏阳性菌有较好的抑制作用。蜡样芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌MAG-C12:0的抑制浓度在25-70mg·l-1范围内(Lee等人。2002年;Preuss等人。2005年)。我们的结果也符合这些值。为了抑制牛奶中的细菌芽孢杆菌,必须使用更高的浓度(250 mg·l-1)。在这种情况下,MAG-C12:0不仅可以抑制芽孢杆菌的生长,而且还可以抑制孢子的产生和萌发(Mansour等人。1999年;曼苏尔和米利埃2001年)。在我们的病例中,对MAG-C12:0的耐药性最强的革兰氏阳性菌是葡萄球菌。金色葡萄球菌CCM 3953在250 mg·l-1浓度时受此MAG的抑制。这一最低抑菌浓度高于在其他葡萄球菌中检测到的抑菌浓度(Lee et al. 2002;Růžička et al . 2003;Preuss等人,2005)。

 

在所测的α-单脂肪酸甘油酯中,MAG-C10:0、MAG-C11:0和MAG-C12:0对革兰氏阳性菌的生长抑制效果最好MAG-C8:0MAG-C16:0似乎对所检测的革兰氏阳性菌效果较差。

 

在比较中链的单脂肪酸甘油酯与偶数和奇数碳的单脂肪酸甘油酯对微生物的抑制作用时,它们对细菌生长的抑制作用没有显著差异。因此,关于含奇数碳脂肪酸的非生理性单脂肪酸甘油酯具有更好的抗菌效果的观点尚未得到证实。

 

革兰氏阴性菌对α-单脂肪酸甘油酯的作用具有相对抗性(ThormarHilmarsson2007),这与我们的结果一致。根据Bergsson等人。(19992002)单脂肪酸甘油酯的抑制作用仅在生活条件明确、对不利环境条件的抵抗力相对较低的革兰氏阴性菌中观察到。在这类细菌中,可能包括沙眼衣原体或淋病奈瑟菌。

 

α-单脂肪酸甘油酯对革兰氏阳性菌的敏感性高于革兰氏阴性菌。然而,单脂肪酸甘油酯对细菌作用的确切机制尚未完全发现,这可以解释这种差异。电子显微镜研究观察了在MAG存在下生长的细菌的形态变化,显示细胞膜在MAG的影响下受损(Bergsson等人。1998年、1999年)。Dufour等人(2007)在粪肠球菌突变株中发现。粪肠球菌对α-单月桂酸甘油酯的抵抗是由细胞表面的变化引起的,因此MAG不能穿透细胞并到达它能起作用的地方。可以认为,在革兰氏阳性细菌中,单脂肪酸甘油酯攻击细胞(细胞质)膜,使其失去半渗透性,从而导致细菌细胞的损伤。在革兰阴性菌中,可能是外膜受到攻击,而细胞膜的半透性不受损伤,因此细菌能够耐受MAG,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁的不同组成可能是MAG对这两类细菌作用不同的原因。

 

总之,所检测的食源性和动物性革兰氏阳性病原体和/或食源性腐败菌主要对含有10-14个碳链的脂肪酸的α-单脂肪酸甘油酯敏感。MAG对革兰氏阳性菌的抑制作用按最低抑菌浓度和生长指标依次为:MAG-C12:0>MAG-C11:0>MAG-C10:0>MAG-C14:0>MAG-C11:1>MAG-C8:0>MAG-C16:0。使用的α-单脂肪酸甘油酯对经检测的革兰氏阴性食源性病原体和/或食源性腐败菌影响较小,使用最高浓度的(1500 mg·l-1)除外。

译自:ResearchGate
作者:Leona Buňková1, František Buňka2, Rahula Janiš1, Jiří Krejčí1, Iva Doležálková1
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