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中链脂肪酸及其α-单脂肪酸甘油酯的抗菌研究:单一作用和协同作

时间:2019-11-21 10:35来源:未知 作者:admin 点击:

 

摘要

对葡萄球菌属、棒状杆菌属、芽孢杆菌属、李斯特菌属和链球菌属的几种革兰氏阳性菌株进行了中链脂肪酸及其α-单脂肪酸甘油酯的抗菌活性评价α-单脂肪酸甘油酯比脂肪酸更具活性,其中α-单月桂酸甘油酯是最具活性的化合物。以化脓性链球菌为试验菌,观察到的效果。首先,阻断α-单月桂酸甘油酯甘油部分的羟基,得到一种具有显著抗菌活性的化合物(MIC,3.9μg/ml)。其次,考察了α-单月桂酸甘油酯与α-单葵酸甘油酯两种组分混合物时,α-单月桂酸甘油酯与α-单葵酸甘油酯之间以及α-单月桂酸甘油酯和活性差的月桂酸之间的协同关系。其中一种组分优于另一种组分2倍的混合物比单独提取的纯组分更为活跃。此外,比例为1:1的组分的存在是不利的。当α-单肉豆寇酸甘油酯的量等于或少于α-单月桂酸甘油酯时,α-单月桂酸甘油酯与单肉豆寇酸甘油酯对金黄色葡萄球菌209存在协同作用。

 

关键词

李斯特菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、中链脂肪酸、α-单脂肪酸甘油酯

 

简介

人们普遍认为,人初乳和牛奶的抗菌活性是由甘油三酯通过脂肪酶水解,释放脂肪酸(FAs)和α-单脂肪酸甘油酯(MGs),它们共同构成母乳喂养婴儿抵御入侵病原体的第一道防线(Isaacs, 2005)。在这些牛奶成分中,中链FAs(C-8到C-14)及其MGs对通过口腔和鼻子传播的病毒和B组链球菌最为有效。因此,这些化合物被用作配方奶的添加剂,以防止或减少婴儿口腔和上呼吸道粘膜的感染(Isaacs等人,1995年)。此外,研究表明,一些中链FAs和MGs抑制了细菌的抗生素抗性基因,并引起了频率相对较低的自然耐药。(Petshow等人,1996;Ruzin和Novick,1998)。这一事实以及发现这些化合物在小浓度下是无毒的,使得它们有望作为抗生素或替代抗生素来治疗不同的疾病((Bergsson等人,2001;Nair等人,2005;Rouse等人,2005)。

 

在所有中链脂肪酸中,月桂酸(C-12)具有最大的抗菌活性。当酸酯化为甘油酯时,这种作用会被放大,从而产生α-单月桂酸甘油酯,中链MGs中抗菌效果最佳。α-单月桂酸甘油酯对革兰氏阳性致病菌和腐败菌具有活性。然而,当与其他物质结合时,其活性可以被加大。例如,当与EDTA 或柠檬酸盐等阳离子螯合剂结合时,α-单月桂酸甘油酯对革兰氏阴性菌具有活性。此外,还可以观察到α-单月桂酸酯与多种其他食品成分(如磷酸酯、抗氧剂和酸化剂)有协同抗菌的作用(马歇尔,1998)。由于其长期安全使用的记录,α-单月桂酸甘油酯单独或与抗生物素相结合,可被证明在预防和治疗严重的细菌感染,特别是那些难以治疗和/或耐抗生素的细菌感染方面是有用的。(Preuss等人,2005年)。

 

本研究初步检测了所有中链 FAs,即辛酸(C-8)、癸酸(C-10)、月桂酸(C-12)和肉豆蔻酸(C-14)及其对应的MGs(α-单辛酸甘油酯、α-单葵酸甘油酯、α-单月桂酸甘油酯和α-单豆蔻酸甘油酯)对葡萄球菌、棒状杆菌、芽孢杆菌、李斯特菌和链球菌等革兰氏阳性菌的有抗菌活性。进一步研究了活性最强的化合物α-单月桂酸甘油酯与抗菌活性较好的化合物之间简单的协同关系。

 

材料和方法

材料。中链脂肪酸辛酸、癸酸、月桂酸和肉豆蔻酸及其合成α-单脂肪酸甘油酯所需的所有化学物质均以高纯度从Aldrich购买。试验培养物:金黄色葡萄球菌Rosenbach 209、金黄色葡萄球菌ATCC 33862 USA、金黄色葡萄球菌146 MR、表皮葡萄球菌1093、白喉杆菌39179、蜡样芽胞杆菌157、单核细胞增生李斯特菌C12和化脓链球菌15346均取自Stefan Angeloff微生物研究所的收藏保加利亚科学院和国家药物管制研究所,索非亚,保加利亚。

 

MGs的合成。MGs的合成分为两个步骤(图1)(Batovska等人,2004)。简单地说,我们首先通过外消旋2,2-二甲基-1,3-二氧环戊烷-4-甲醇和酸性氯化物的反应得到了它们的丙酮化合物。用强酸性离子交换树脂对生成丙酮化合物进行保护。

 

 

琼脂扩散法。用琼脂扩散法检测肉质蛋白胨琼脂上生长的细菌的抗菌活性(Spooner和Sykes,1979)。将200微升的细菌悬液(105个细胞/毫升)被置于培养皿的琼脂层上(直径10厘米)。每个盘子准备5个孔,每个孔直径10毫米。将100微升的每个样品,溶解在96%乙醇溶液(5000µg/ml)中再添加到适当的孔中。对于预扩散,将培养皿放置在4°C下2 h。在37°C下培养48 h后,根据琼脂层中抑制区的直径估计抗菌活性,实验三次重复进行,具有至少16mm直径的抑制区的化合物具有活性。对照组试验用纯溶剂进行。

 

连续稀释法。采用在线实验室手册(2000)中所述,用肉汤管稀释法测量单个化合物及其混合物的最小抑制浓度(MIC)。用Mueller-Hinton肉汤将每个样品在试管中连续稀释至0.0-2000 µg/ml,测定MIC。每根试管接种含有105个细胞/ml的细菌悬浮液,并在35℃下培养过夜与接种有微生物悬浮液的无药肉汤相比,明显没有生长的最高稀释度被认为是MIC。为了更精确的检测,在新鲜肉类蛋白胨琼脂平板上划出没有可见生长的试管,在35℃下培养24小时,并检查生长情况。

 

结果和讨论

本研究评价了中链脂肪辛酸(C-8)、癸酸(C-10)、月桂酸(C-12)和肉豆蔻酸(C-14)及其对应的MGs(α-单辛酸甘油酯、α-单葵酸甘油酯、α-单月桂酸甘油酯和α-单肉豆蔻酸甘油酯)对革兰氏阳性菌的抗菌活性表一和表二分别列出了FAs和MGs的抑制区(dinh)和最小抑制浓度(MIC)的直径。

 

中链脂肪酸及其α-单脂肪酸甘油酯的抗菌活性

表一:中链FAs的抗菌研究结果

a金黄色葡萄球菌 209, b金黄色葡萄球菌 146 MR, c金黄色葡萄球菌 ATCC 33862 USA

 

脂肪链具有12个碳的α-单月桂酸甘油酯是所有被测化合物中最活跃的(表二)它能强烈的抑制葡萄球菌和链球菌的生长。这是唯一对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌有效的化合物。其他的MGs,如α-单葵酸甘油酯和α-单肉豆蔻酸甘油酯区与α-单月桂酸甘油酯相差2个碳原子,其活性明显降低,而8个碳原子的脂肪链的α-单辛酸甘油酯没有表现出任何活性。

 

表二:中链GMs的抗菌研究结果

a金黄色葡萄球菌 209, b金黄色葡萄球菌 146 MR, c金黄色葡萄球菌 ATCC 33862 USA 

 

众所周知,月桂酸具有抗菌活性,当脂肪酸与甘油酯化生成α-单月桂酸甘油酯时,其抗菌活性增强。有一种说法认为,α-单月桂酸甘油酯的甘油部分是亲水载体,可以通过细菌细胞膜传递月桂酸,在细菌细胞膜上表现出抗菌活性(Ruzin和Novick,2000)。如果是这样的话,我们可以测α-单月桂酸甘油酯将显示出比月桂酸更强的抗菌活性。此外,通过保护其羟基消除甘油部分的亲水性将导致更多的非活性化合物。在这一关系中,我们比较月桂酸、α-单月桂酸甘油酯和具有两个封闭羟基的α-单月桂酸甘油酯的丙酮化合物的抗菌效果(表三)。未结合的月桂酸抑制化脓性链球菌,MIC为125微克/毫升。当酸与甘油结合时,这种活性增加了4倍。出乎意料的是,阻断α-单月桂甘油酯中甘油部分的两个羟基有利于其抗菌活性,而α-单月桂酸甘油酯的丙酮化合物的抗菌活性是游离月桂酸的32倍,是α-单月桂酸甘油酯的8倍。该化合物对化脓性链球菌细胞有一定的特异性作用。此外,α-单脂肪酸甘油酯的丙酮化合物对其他细菌,如单核细胞增生李斯特菌和白喉杆菌完全不起作用(表三)。这可能是因为甘油部分受保护的羟基干扰了整个分子通过这些细菌细胞膜的渗透。

 

表三

月桂酸、α-单月桂酸甘油酯和单月桂酸甘油酯的丙酮化合物对所选细菌的MIC值 (µg/ml)

 

考虑到α-单月桂酸甘油酯的抗菌活性会受到其他活性化合物的影响,我们检测了该MGs的一些两种混合物和最接近的抗菌活性的化合物。因此,我们选择α-单葵酸甘油酯和α-单肉豆蔻酸甘油酯作为继α-单月桂酸甘油酯对抗金黄色葡萄球菌209后的第二大活性成分,并以不同比例分别与α-单月桂酸甘油酯混合这些混合物对金黄色葡萄球菌209的抗菌研究结果表明,只有当α-肉豆蔻酸甘油酯的含量与α-单月桂酸甘油酯相同(比例1:1)或较少(比例1:2)时,才具有协同作用(图2)。α-单葵酸甘油酯不与α-单月桂酸甘油酯发生协同作用(图2)。当使用单核细胞增生李斯特菌和白喉杆菌作为试验菌时,月桂酸也发现了同样的情况(图3,图4)。当对化脓性链球菌进行研究时,发现α-单月桂酸甘油酯和α-单葵酸甘油酯以及α-单月桂酸甘油酯和活性差的月桂酸之间存在协同关系(图5)。在这些情况下,可以观察到其中一种组分比另一种组分占优势2倍的混合物比单独的纯组分更为活跃。此外,比例为1:1的组分的存在是不利的。活性的α-单月桂酸甘油酯与月桂酸之间的协同关系,表明,α-单脂肪酸甘油酯与抗菌活性较弱的化合物的组合也值得关注。在这方面,不仅应检查两种成分的混合物,而且还应检查含有3种以上组分的复杂混合物。

 




 

总之,中链MGs比中链FAs更具活性,其中α-单月桂酸甘油酯对各种革兰氏阳性菌的抗菌活性最强以化脓链球菌为试验微生物,观察到以下作用:1)阻断α-单月酸甘油酯的甘油部分的羟基,得到具有显著抗菌活性的化合物;2)对其两种组分混合物进行检测,发现α-单月桂酸甘油酯与α-单葵酸甘油酯、α-单月桂酸甘油酯与活性差的月桂酸之间存在协同关系。

 

混合后α-肉豆蔻酸甘油酯的含量与α-单月桂酸甘油酯相同或较少时,α-肉豆蔻酸甘油酯和α-单月桂酸甘油酯对金黄色葡萄球菌209也存在协同作用。

 

根据所观察到的效果,可以开发出有效的抗菌化合物和脂质混合物。

 

致谢 :

这项工作得到保加利亚国家科学研究基金会(合同X-1514)的支持。

 

 

译  自:ResearchGate

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(责任编辑:admin)
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