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绿藻硫化多糖通过TLR4激活PI3K/Akt信号通路诱导肠道细胞因子生成

时间:2019-10-07 09:20来源:未知 作者:admin 点击:

 

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摘要
 
 
 
 

探讨了水溶性绿藻硫化多糖(Ulvan)作为生物活性分子对人体和动物健康的影响。从布列塔尼(法国)采集的绿藻Ulva armoricana中制备出一种纯度较高的水溶性绿藻硫化多糖,并使用猪肠上皮细胞(IPEC-1)体外系统测试其刺激肠道免疫反应的能力。RT-qPCR和ELISA分析CCL20, IL8,TNFα等细胞因子的mRNA和蛋白表达有显著增加。利用人类胚胎肾(HEK293)细胞系作为模式识别受体,发现绿藻硫化多糖主要刺激TLR4。我们还研究了绿藻硫化多糖对细胞因子基因表达激活过程中不同信号通路的影响。蛋白质印迹法分析表明,绿藻硫化多糖处理的HEK293-TLR4细胞显示蛋白激酶B(Akt)的磷酸化和核因子κB 的p65亚基的增加。用特异性抑制剂抑制Akt磷酸化可消除绿藻硫化多糖介导的IL -8分泌增强。整体结果表明,绿藻硫化多糖自身就是一种免疫刺激化合物,在疫苗接种策略中可以有效地将TLR配体复合物传递给相关免疫细胞。

 

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关键词
 
 
 
 

 海藻  绿藻硫化多糖  肠上皮细胞  免疫刺激因子

 

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介绍
 
 
 
 

海藻藻类化合物具有多种生物活性,在食品、化妆品、医药、微生物学和生物技术等领域有着广泛的应用[1],[2]。海洋藻类产生的生物活性代谢物主要是多肽、多不饱和脂肪酸、色素、多酚和多糖[3]、[4]。高度复杂的硫化多糖普遍存在于绿藻、褐藻和红藻三种主要海藻的细胞壁基质中,其含量占干重的4% ~ 76%。[5]、[6]、[7]。从绿藻、褐藻和红藻中提取的硫化多糖分别称为绿藻硫化多糖,岩藻聚糖,卡拉胶[5], [6], [7], [8], [9]。从硬石莼和浒苔等绿藻中的绿藻硫化多糖主要与糖醛酸相连的硫酸鼠李糖残基组成,形成一个重复的二糖单元β-d-葡萄糖醛酸-(1,4)-α-l-鼠李糖3-硫酸酯,称为醛酸[10].。体外和体内研究表明,绿藻硫化多糖,类似于岩藻聚糖和卡拉胶,具有广泛的生物活性,如抗凝血、抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗增殖和免疫调节活性[11], [12], [13], [14].。对低分子量的绿藻硫化多糖功能的筛选中表明,它们与免疫细胞的相互作用,导致免疫系统的激活或控制炎症过程[15], [16].。最近的研究表明,绿藻硫化多糖能增强巨噬细胞的吞噬功能和其他功能,如活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的产生以及促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(TNFα)、IL-1、IL-6、IL-8, IL-12和干扰素(IFN)的分泌。[17], [18], [19], [20]. 此外,用脂多糖(LPS)激活的巨噬细胞系研究了绿藻硫化多糖的抗炎作用,发现脂多糖诱导的促炎细胞因子,包括IL-1β, IL-6和TNF-α的分泌显著减少,NO的产生也显著减少。这些数据表明,低分子量的绿藻硫化多糖具有免疫调节活性,但其参与免疫反应调节的分子机制尚不清楚。然而,海洋免疫调节性卡拉胶和岩藻多糖,像那些来自植物、真菌或酵母的多糖,能够通过结合toll样受体,如TLR4,直接调节天然免疫反应。在靶细胞上表达并诱导导致转录因子NF-kappa B活化的信号通路[24], [25]。

 

例如,红藻λ-卡拉胶以Toll样受体-4(TLR4)依赖的方式刺激小鼠T细胞培养,产生T辅助因子1(Th1)模式的细胞因子反应。然而,从TLR4缺陷小鼠制备的脾细胞仍然保留了对λ-卡拉胶产生干扰素-γ的一些能力,这表明除TLR4以外的模式识别受体(PRR)也参与这一过程[26]。卡拉胶也被用作佐剂,并通过TLR4途径在接种了人乳头瘤病毒E7肽的小鼠中产生高抗原特异性免疫反应[27]。岩藻聚糖通过膜受体TLR4、CD14和A类清道夫受体以及MAPK信号途径诱导巨噬细胞活化[28]。岩藻聚糖还通过转录因子NF-kB.的途径对骨髓来源的树突状细胞具有免疫刺激和成熟作用。然而,所涉及的受体尚未确定[29]。

 

很少研究在法国海岸采集的海藻调节免疫反应的潜力。近年来,首次在2012年从布列塔尼地区北部海岸收获的大型绿藻Ulva armoricana中提取了绿藻硫化多糖(MSP),并对其抗菌和免疫刺激活性进行了评估。结果表明,该MSP提取物能抑制病原菌的生长,并能通过猪肠上皮细胞系IPEC-1的体外系统,刺激IL1α、IL1β、L6、IL-8、TNFα、TGFβ和CCR20等免疫应答介质的mRNA表达[30]。

 

在本研究中, 以2013年同一地区收获的藻类为原料,采集一批新的MSP批次,用于绿藻硫化多糖的提纯。我们首先尝试通过与MSP提取物的比较来评估这种绿藻硫化多糖的免疫刺激活性,然后阐明这种生物活性的分子机制。因此,我们利用体外IPEC-1模型研究了该绿藻硫化多糖是否能够刺激细胞因子的表达,并评估其与表达一组PRRs的HEK293细胞系的相互作用,以识别目标受体。我们还对TLR刺激后参与细胞因子表达的信号通路进行了识别。了解绿藻硫化多糖介导的免疫刺激活性的机制,对于设计生物活性多糖作为促进健康的分子,为未来的预防/治疗策略,增强宿主的免疫应答,具有重要意义。

 

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材料和方法
 
 
 
 

2.1. 绿藻硫化多糖的制备

2013年6月,在Plestin les Grèves海滩(法国布雷塔涅,48°39′28〃N 3°37′47〃W)采集到绿藻石莼,然后用水冲洗藻类,排干水分并冷冻。作为一个工业过程的一部分,藻类被解冻,湿磨,液相和固相被分离。液体通过切向过滤(Tami Industries,Nyons,France)进行分馏,并集中在单效浓缩器(EVA 1000,Pignat,Genas,France)上。滤液经过冷冻干燥机(Christ Alpha 1–4 LSC,Fisher Scientific,France)进行干燥,冷冻干燥后的材料使用珠磨机(Minimill,Philips,France)研磨成粉末,每个珠磨机有两个锆碗和四个锆珠。对MSP提取物进行脱盐处理,绿藻硫化多糖的纯化如前所述进行[30]、[31]。本文还对绿藻硫化多糖的生化分析、蛋白质和糖成分以及分子量进行了介绍[30]、[31], 使用商用试剂盒(E-toxate试剂盒,Sigma)对不同组分的LPS污染进行了评估。两种制剂均未检出LPS。

 

2.2. IPEC-1与绿藻硫化多糖的培养、分化和刺激。

IPEC-1细胞系是一种来源于未哺乳仔猪小肠的非转化上皮细胞[32]. 如前所述,用粗提物或纯化的绿藻硫化多糖进行培养、分化和刺激[30]。简单地说,细胞在添加5%胎牛血清、1%胰岛素-转铁蛋白硒、2mM谷氨酰胺、5ng/mL表皮生长因子、50U/mL青霉素和50mg/mL链霉素的DMEM/HAMF-12中培养。IPEC-1细胞培养2天,达到完全融合,培养后在含有10-7M地塞米松、缺乏胎牛血清的培养基中分化12天。在进行刺激实验前,使用台盼蓝染色和显微镜观察/计数方法检测MSP提取物(0-10mg/mL)或绿藻硫化多糖(0-1mg/mL)的细胞毒性作用如前所述[30]。当浓度为500μg/ml时,72h仍不影响细胞增殖。因此,将IPEC-1细胞以3.5×105个细胞的密度分三次接种到4.2 cm2插入式细胞培养皿(孔径为0.4μm)上,并如上所述进行分化。在细胞培养14天后,用浓度为500μg/ml的MSP提取物和绿藻硫化多糖的两个连续的十进制稀释液(50和5μg/ml)在37°C的湿化培养箱中用5%的二氧化碳刺激上皮细胞4h。

 

2.3. IPEC-1刺激后细胞因子表达分析

采用定量实时荧光定量PCR(qPCR)和ELISA法分别检测IPC- 1细胞分化过程中IL-8、TNFA和CL20的表达。RNA提取、cDNA合成和qPCR如所述进行[30]。简而言之,在IPEC-1刺激后的4小时,高质量RNA用 Nucleospin RNA-L 试剂盒纯化,1μg 总RNA 使用MuMLV逆转录酶逆转录。在93℃热灭活5分钟后,用MeSa Green qPCR Mastermix Plus进行SyBR分析(Eurogentec, Angers,France)对生成的cDNA进行qPCR。用于扩增细胞因子和管家基因的引物如表1所示。qPCR数据使用2∆∆C t方法进行分析,其中目标基因的数量由2-∆∆Ct给出,标准化为一个内源性参考和相对于实验对照[30]。与未经处理的对照细胞相比,结果显示为相对折叠变化(Fc)。为了进行蛋白质分析,分化的IPEC-1细胞在37℃的加湿培养箱中用500 μg /毫升的绿藻硫化多糖在5%的二氧化碳中培养过夜。然后顶端和基底外侧上清液被移除,并用商业试剂盒(R&D Systems, Lille, France)用ELISA法测定IL - 8和TNFα的产生。

表一。用于RT-PCR分析的引物对的特性。引物序列(5'→ '3')、引物对的退火温度(℃)、预期的PCR片段大小(bp)和用于构建引物的基因的公开登录号。在这项研究中强调使用的管家基因。

 

 

2.4. 绿藻硫化多糖受体的鉴定

从Invivogen (Invivogen, Toulouse, France),购买了5个不同的人类胚胎肾(HEK293)细胞系,每个细胞系都有不同人的TLR4, TLR5, TLR9, NOD1, 或NOD2的结构。这些细胞系通常用于通过评估与HEK293空白细胞相比IL-8的产生,在配体刺激下TLR或NOD受体的激活。HEK293-TLR4细胞也表达TLR激活所需的MD-2和CD14共受体。在DMEM培养基 (Life Technologies Europe B.V.)中培养细胞,其中含有10%热灭活牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、4.5 g/L D-葡萄糖、青霉素/链霉素(分别为50 U/ml和50 mg/ml,)和Normocin(防止细胞培养中支原体、细菌和真菌污染的试剂)(100 mg/ml)。细胞保存在75平方厘米的组织培养瓶(Greiner-BioOne, Germany)中,温度为37℃,二氧化碳浓度为5%的培养箱中。在受体鉴定实验中,将细胞以1.5×106个细胞/孔的密度在六孔培养板中进行培养(Becton Dickinson Labware, Le Pont De Claix, France)。培养48小时,然后用浓度为500μg/ml的绿藻硫化多糖刺激16小时。产生的上清液用于通过ELISA(Peprotech,Neuilly Sur Seine,France)定量IL-8的产生。作为阳性对照,使用推荐的激动剂,超纯LPS O111B4(100 ng/ml)用于TLR4,鞭毛蛋白(100 ng/ml)用于TLR5,CPG-ODN 2395(10μg/ml)用于TLR9,iE-DAP(1μg/ml)用于NOD1 和MDP(1μg/ml)用于NOD2,。所有激动剂均从Invivogen购买,除了LPS O111B4是从Sigma获得的。

 

2.5. 蛋白质印迹法分析信号通路

研究了Erk1/2(胞外信号调节激酶)、p38 MAPK,和AMPK((AMP激活蛋白激酶)MAPK信号通路以及PI3K/Akt1/2(磷脂酰肌醇3激酶)和NF-κB信号通路。在受体识别实验中,将HEK-TLR4/MD-2细胞以1.5×106细胞/孔的密度在6孔培养板中培养48h,然后用500μg/ml的绿藻硫化多糖刺激5、10、30或60分钟,取上清液,通过ELISA (Peprotech, USA)测定IL-8含量。此外,蛋白质制备和蛋白质印迹法分析如所述进行[33]。简单地说,细胞被含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液破坏。用SDS-PAGE分离等量的蛋白质,并转移到硝化纤维素膜上。膜被封闭,并在1:1000的最终稀释度下与适当的一级抗体培养。清洗后,用辣根过氧化物酶结合的二级抗体(最终稀释度1:10000)在室温下培养2小时,用增强化学发光法(Western Lightning Plus ECL,Perkin Elmer,Courtaboeuf,France)使用Syngene G:Box系统(Ozyme, Saint-Quentin-en-Yvelines, France)Genesnap软件(Syngene UK, Cambridge, UK, release 7.09.17)。利用GeneTools软件(Syngene UK, release 4.01.02)对检测到的信号进行量化,结果如图图例所示,经归一化后以任意单位表示为信号强度。

 

 2.6. 用蛋白质印迹法检测的抗体

抗p-Akt (Ser473), p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204), p-p38 (Thr180/Tyr182)和p- NF-κB p65 (Ser536)的抗体购自Ozyme (Saint quentin en Yvelines, France),而p-AMPK (Thr172)抗体购自荷兰细胞信号技术公司。从Tebu Bio (Le Perray-en-Yvelines, France)和Ozyme中获得了抗总AKT、ERK1/2、p38、AMPK和NF-κB的单克隆和多克隆抗体。所有抗体在1:1000稀释下用于分析。

 

2.7. 抑制Akt1/2信号通路

为了研究Akt在细胞因子表达中的作用, 用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)(Sigma)的药物抑制剂LY294002预处理HEK293-TLR4细胞。为了保证DMSO在培养基中的最终浓度不超过0.1%,将溶液配制成1000倍的二甲基亚砜(DMSO)浓缩液。在刺激前1h,以50μm的最终浓度用LY294002抑制剂处理HEK293-TLR4细胞,以阻断绿藻硫化多糖刺激4和16h的信号通路。培养步骤结束后,收集培养基,根据制造商的说明,使用商用试剂盒(研发)通过ELISA测定IL-8的浓度。对照组用DMSO在DMEM中培养。我们还检测了LY294002对PI3K信号通路的抑制是否对HEK293-TLR4细胞有细胞毒性作用。用50μm的LY294002、DMSO或DMEM处理细胞,如前所述,用台盼蓝染色和显微镜观察/计数评估细胞活力。比较处理细胞和未处理细胞之间mRNA表达和蛋白质产生差异的数据以相对值表示。数据表示为三次重复的平均值±SEM的平均值。由于数据是独立且非正态分布的,因此使用Kruskal-Wallis试验和Bonferroni-Dunn试验组后使用GraphPad(GraphPad Prism 4.00 for Windows;GraphPad Software,San Diego,CA,USA)对数据进行分析。当p值<0.05(*)或<0.01(*)时,各处理间的统计差异被认为是显著的。

 

 

1

 
 
 
 
结果
 
 
 
 

3.1.绿藻硫化多糖的成分

通过元素分析、工业分析、糖单元分析和分子量测定,确定了粗提物和精制绿藻硫化多糖的化学成分。表2显示,净化步骤去除了所有盐和矿物质,使灰分含量从32.9%降至2.9%。工业分析表明,该工艺还使有机质含量提高到92.5%,主要由碳水化合物和蛋白质组成。MSP提取物的糖成分分析结果无意义且不可用,检测到的糖含量低,标准误差值高,这与在高盐含量较高的情况下重复性较差有关。经过超滤步骤去除样品中的盐分,得到的有机物为89.6%,其中72.4%为碳水化合物,主要是中性糖和糖醛酸。计算了绿藻硫化多糖的产出率,其值为20.5%。

 

表2。本研究所用之低分子量MSP水提取物及纯化的绿藻硫化多糖的组成。直接对纯化的绿藻硫化多糖进行糖单元组成分析。N.D.表示未确定。

糖残基的成分以低标准偏差测定,占干重的70.9%,略低于工业分析结果。最终确定的绿藻硫化多糖由39.55%鼠李糖、32.2%醛酸、24.4%葡萄糖醛酸、2.75%木糖和8.3%硫酸盐组成。分子量平均(Mw)为3.2×103,分子量平均(Mn)为2.9×103da,多分散指数为1.1。

 

3.2.绿藻硫化多糖刺激IPEC-1细胞 IL-8, TNF-α 和CCL20mRNA的表达

在研究两种提取物的刺激作用之前,通过增加MSP提取物(图1A)和绿藻硫化多糖(图1B)的量对IPEC-1细胞培养来检查细胞毒性作用,并使用台盼蓝排斥试验测定细胞活性。在0.5mg/ml时,细胞没有明显的细胞毒性,细胞增殖也没有受到影响。首先在mRNA水平上研究了诱导分化的IPEC-1细胞在500、50和5μg/ml浓度下暴露4h后,与MSP粗提物相比,绿藻硫化多糖刺激细胞因子表达的能力。结果表明,500μg/ml的MSP提取物能显著提高CCL20 (74.9), IL-8 (× 85.4) 和 TNF-α (× 29.9) 的相对表达(p<0.01)。纯化步骤不影响绿藻硫化多糖的生物学活性,并保留了IPEC-1细胞中细胞因子表达的活性。事实上,mRNA表达分析显示纯化的绿藻硫化多糖增加了CCL20 (× 61.5), IL-8 (× 79.7) 和TNF-α (× 36.4) 的表达,其程度与MSP提取物相似(图2A和B)。

 

图1

图1。用不同浓度的MSP提取物(0-10 mg/ml) (a)或纯化的绿藻硫化多糖 (0-1 mg/ml) (b)处理IPEC-1细胞,用台盼蓝染色和显微镜观察/计数评估3天后(D0, D1, D2 and D3) 的细胞活力。数据表示为三次重复的平均值±S.E.M.。在孵育3天(D3)后,将结果与未经处理的对照组进行比较。不同字母表示差异有统计学意义(a、b、c、d),p<0.05。

 




 

图2

图2。用MSP提取物(A)和纯化的绿藻硫化多糖(B)刺激分化猪上皮细胞(IPEC-1)中IL-8, TNFα, 和 CCL20的表达。用不同浓度(500、50和5μg/ml)的提取物处理IPEC-1细胞4h,测定靶基因表达与对照组相比的倍数变化。数据表示为三组的平均值±S.E.M.,结果在p值<0.01时具有统计学意义(p<0.01)。

 

3.3.绿藻硫化多糖诱导分化的IPEC-1细胞分泌IL-8和TNF-α蛋白

在证明分化的IPEC-1细胞能够在mRNA水平上表达细胞因子以响应纯化的绿藻硫化多糖后,我们试图通过ELISA分析来证实和扩展这一结果。将IPEC-1细胞在transwell滤波器上培养,加入浓度为500μg/ml的绿藻硫化多糖刺激一夜,分别分析顶端和基底外侧细胞的上清液。如图3所示,绿藻硫化多糖能够刺激IL-8和TNFα的蛋白分泌到收集的上清液中,但根据隔室的不同,其水平不同。与未经治疗的对照组相比,在顶端(5446±308pg/ml)和基底外侧(1980±190pg/ml)室中检测到明显增加的IL-8(p<0.01)。绿藻硫化多糖治疗也刺激了IPEC-1细胞释放TNF-α但水平远低于IL-8(125.5±18.5pg/ml,5446±308pg/ml,7.8±1.2pg/ml,1980±190pg/ml)。在接下来的实验,只对绿藻硫化多糖进行评估。


图3

图3。纯化的绿藻硫化多糖刺激分化的IPEC-1细胞产生TNFα 和 IL-8蛋白。将IPEC-1细胞与500μg/ml的绿藻硫化多糖在37℃培养一夜,分别收集顶端和基底外侧上清液,并使用商业ELISA试剂盒进行蛋白质分析。p值低于0.01(p<0.01)时,其结果具有统计学意义

  

3.4.绿藻硫化多糖诱导HEK293-TLR4细胞IL-8蛋白表达

为了鉴定相关受体,在500μg/ml浓度下检测了稳定表达TLR4, TLR5, TLR9, NOD1 和 NOD2.受体的HEK293细胞株中的绿藻硫化多糖。通过ELISA检测IL-8在上清液中的释放,评价绿藻硫化多糖/受体的相互作用。结果表明,与HEK293空白细胞相比,纯化的绿藻硫化多糖能够激活TLR4,诱导HEK293/TLR4-MD-2-CD14细胞产生IL-8。这一部分没有显著激活任何剩余的受体(图4)。


图4

图4。纯化的绿藻硫化多糖只刺激HEK293-TLR4细胞产生IL-8蛋白。HEK293-TLR4、TLR5、TLR9、NOD1和NOD2细胞以1.5×106细胞/孔的密度在6孔培养板中进行培养,并用浓度为500μg/ml的绿藻硫化多糖或推荐的激动剂作为阳性对照刺激16h。使用超纯LPS O111B4(100 ng/ml)作为TLR4的激动剂,鞭毛蛋白(100 ng/ml)作为TLR5的激动剂,CPG-ODN 2395(10μg/ml)作为TLR9的激动剂,iE-DAP(1μg/ml)作为NOD1的激动剂,MDP(1μg/ml)作为NOD2的激动剂。数据表示为三次重复的平均值±S.E.M.,当p值低于0.01时,IL-8的产生被认为具有统计学意义(p<0.01)。

 

3.5.绿藻硫化多糖与TLR4介导PI3K / Akt激活和NF-κB信号通路

接下来,我们研究了纯化的绿藻硫化多糖对参与细胞因子基因表达的不同蛋白激酶激活的影响。因此,将HEK293-TLR4细胞与绿藻硫化多糖(500μg/ml)培养不同时间(5、10、30和60分钟),用磷酸特异性抗体评估磷酸化状态的MAPKs (ERK1/2和p38)、Akt, AMPK 和NF-κB。蛋白质印迹结果和pAkt/Akt的动力学曲线分析表明,HEK293细胞中绿藻硫化多糖与TLR4的相互作用导致Akt磷酸化显著增加,与未处理的细胞相比,培养5分钟后可检测,可以检测到Akt磷酸化水平的显著提高,与经LPS处理的细胞相似(图5A和B)。MAPKs (Erk1/2 和 p38)和AMP激活激酶的磷酸化状态分析表明,不同的处理之间这些信号通路的激活没有任何差异(数据未显示)。Akt通过诱导核因子-κB (NF-κB)的磷酸化及其抑制剂的降解来调节核因子-κB (NF-κB)的转录活性。因此,我们分析了p65在HEK293-TLR4细胞中的磷酸化状态,如图6A和B所示,我们观察到绿藻硫化多糖显著增加了磷酸化p65的水平。

 

图5

图5。绿藻硫化多糖诱导表达TLR4的HEK293细胞Akt磷酸化。用500μg/ml的绿藻硫化多糖刺激HEK293-TLR4细胞5、10、30或60min,分析细胞裂解液中Akt和磷酸-Akt (p-Akt)的表达。蛋白质印迹(A)和pAkt/Akt (B)的动力学曲线结果均表示为三次重复的平均值±S.E.M.,*p<0.05表明处理组与DMEM对照组之间存在显著差异。

图6

图6。绿藻硫化多糖激活HEK293细胞NF-κB信号通路表达TLR4。免疫印迹分析(A)和动力学曲线结果(B)为未经处理的HEK293-TLR4细胞(DMEM)的提取物或绿藻硫化多糖或LPS使用抗磷酸化-NF-κB p65 (Ser536)抗体刺激不同时间(5、10、30或60分钟)。数据以三组的平均值±S.E.M.表示,*p<0.05表明治疗组和DMEM对照组之间存在显著差异。

 

3.6.抑制剂LY294002对pi3k/akt信号通路的抑制作用

我们首先检测了药物抑制剂LY294002对HEK293-TLR4细胞的增殖是否有细胞毒性作用。与单用DMEM相比,用LY294002或DMSO处理细胞即使在培养16h后也不会影响细胞活力(图7A)。然后使用抑制剂LY294002验证PI3K/Akt信号通路的参与。在最终浓度为50μm的情况下使用该抑制剂16h,能够阻断该信号通路,并诱导IL-8分泌减少65%(图7B)。用脂多糖处理的细胞也得到了类似的结果,而LY294002对未处理细胞的IL-8分泌没有影响(图7b)。

图7

图7。LY294002是PI3K/Akt信号通路的药物抑制剂,在不影响细胞活力的情况下,可以抑制由绿藻硫化多糖诱导的HEK293-TLR4细胞产生IL-8。(A)用50μmLY294002、DMSO或DMEM处理HEK293-TLR4细胞,用台盼蓝染色测定细胞活力。(B)HEK293-TLR4细胞在用纯化的绿藻硫化多糖(500μg/ml)或脂多糖(LPS)刺激前用LY294002预处理。IL-8浓度和细胞数/cm2表示为三组的平均值±s.e.m.。**p<0.01表明不同处理间存在显著差异。NS:不重要。

 

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讨论
 
 
 
 

近年来,绿藻作为一种生物活性天然化合物的丰富而重要的来源,可以作为新一代的生长促进剂和天然抗生素替代品来增强免疫功能,减少家畜的感染,从而改善动物健康[34],[35]。然而,还需要进一步的研究来确定生物活性成分、作用机制和体内生物效应,最终将这些发现应用于农业生产。在这种背景下,我们最近从绿藻Ulva armoricana中制备了一种绿藻硫化多糖(MSP)粗提物,并利用猪肠上皮细胞系IPEC-1的体外系统显示了其刺激多种细胞因子和趋化因子mRNA表达的能力[30]。化学成分分析表明,该提取物的主要成分之一为绿藻硫化多糖。该成分被认为是免疫刺激活性的主要候选成分,但需要进一步纯化样品才能最终确认。在本研究中,我们从2013年夏天在同一地区采集的藻类中制备了一批新的MSP,并纯化了绿藻硫化多糖部分,以评估其与MSP提取物相比的免疫调节潜力。新MSP提取物的成分分析显示,其成分与之前制备和测试的MSP提取物成分相似[30]。纯化过程使我们获得了有机质含量高(高达89.6%)的绿藻硫化多糖,其中72.4%是碳水化合物,主要是中性糖和糖醛酸。最终确定的绿藻硫化多糖的成为为鼠李糖39.6%,糖醛酸32.2%,葡萄糖醛酸24.4%,木糖2.8%,硫酸根8.3%,蛋白质8.9%,是绿藻绿藻硫化多糖的典型的主要成分。此外,元素分析还揭示了蛋白质的存在,硫化多糖与绿藻细胞壁结构内的蛋白质密切相关的事实是一致的,如前所述[10],[36]。

 

用新的MSP处理分化的IPEC-1细胞以及纯化的绿藻硫化多糖诱导CCL20, TNFα 和 IL-8,mRNA.的上调。此外,纯化的绿藻硫化多糖能够刺激基底部和顶部细胞因子的分泌。这些结果与先前获得的结果相似,表明该提取工艺适合制备具有可重复分析成分和免疫刺激活性的MSP提取物[30]。此外,纯化步骤对于提高免疫刺激效果特别有用,这可能归因于绿藻硫化多糖。MSP提取物和绿藻硫化多糖对的肠细胞因子产生的刺激不能归因于内毒素污染,因为通过E-Toxate试剂盒分析(数据未显示)未在粗多糖和分离多糖中检测到内毒素化合物。本研究对于确定最佳提取工艺,生产具有有效免疫刺激活性的天然生物活性分子,用于家畜饲料中,提高家畜的免疫应答能力,提高家畜的免疫功能,从而增强动物对传染病的抵抗力,具有重要的现实意义。

 

评估藻类多糖免疫特性的研究主要是利用小鼠RAW264.7等巨噬细胞系进行的,很少在肠上皮细胞上进行。与岩藻聚糖和卡拉胶一样,绿藻硫化多糖也直接在巨噬细胞细胞系上进行试验,或者用脂多糖对巨噬细胞刺激后,分别检测免疫刺激反应和抗炎反应 [15]、[16]。虽然巨噬细胞是先天免疫的重要效应细胞,但肠道上皮细胞也很受关注,因为它们表达模式识别受体(PRRs),使它们能够充当微生物环境和外来抗原的动态传感器。因此,我们的研究中使用的分化的IPEC-1细胞是一个相关的、合适的体外模型,它将允许测试和评估膳食生物活性化合物(如海藻硫化多糖)摄入,对刺激肠道免疫反应的影响。已经清楚的是,肠上皮细胞是肠内稳态的重要介质,通过产生广泛的细胞因子参与邻近免疫细胞的激活、运输和功能,增强屏障功能并参与适当黏膜免疫应答的协调[37],[38],[39]。由于它们能够识别特定的碳水化合物部分并引发免疫反应,我们假设PRRs,更具体地说TLRs和NODs,被绿藻硫化多糖激活,通过信号级联,导致细胞因子产生的刺激。因此,我们使用HEK细胞模型来靶向大量TLR和NOD受体,并证明绿藻硫化多糖能够激活表达TLR4的HEK细胞的免疫信号。这意味着绿藻硫化多糖可以通过TLR4直接作用于靶细胞,包括肠道或免疫细胞,并对免疫参数的表达产生差异性影响。我们还分析了信号通路的激活,并表明绿藻硫化多糖和TLR4的相互作用介导了PI3K/AKT信号通路的激活,通过特异性药物抑制剂LY294002证实了PI3K/Akt通路的参与。在先前的一份报告中,正常人结肠上皮细胞系NCM460暴露于从红藻中纯化的硫化多聚半乳糖卡拉胶(CGN)中,显示出对IL-8产生的刺激。与我们的研究类似,这个CGN能够识别TLR4受体,诱导B细胞淋巴瘤-NF-κB活化,介导细胞因子的产生[40]。 

 

据报道,在不同细胞中,PI3K/Akt通路的激活与的TLR2, TLR3, TLR4, 和 TLR5有关[41],[42],并在TLR信号传导中起促炎和抗炎作用[43],[44]。因此,正如其他海藻多糖提取物所报道的那样,绿藻硫化多糖可能具有双重作用和免疫调节活性,可能在刺激免疫反应或控制炎症方面具有潜在的应用价值[15], [21]。

 

总的来说,这些体外数据为海藻硫酸多糖刺激可溶性细胞因子和趋化因子产生的分子机制提供了新的见解,并表明这种信号可以通过与TLR4的相互作用实现,诱导PI3K/Akt 和NF-κB通路的激活。尽管这些体外实验结果有助于解释绿藻硫化多糖刺激细胞因子表达的分子机制,但我们不能排除其他受体和其他信号途径,通过肠表面可能更复杂的机制参与的可能性。天然TLR配体(TLRLs)及其类似物在免疫治疗中的应用日益广泛。由于TLRLs是天然免疫反应的有效诱导物,因此它们被用作佐剂来刺激适应性免疫反应[45]。制药工业将天然衍生聚合物作为多功能材料应用于药物递送领域,已成为一个越来越受关注的课题,推动了此类化合物的不断开发[46]。海藻硫化多糖由于其离子性质,近年来被应用于纳米颗粒和微粒的制备中[47]。因此,TLR配体可以被包裹在可生物降解的绿藻硫化多糖纳米颗粒中,以在疫苗接种策略中传递给相关的靶免疫细胞。

 

参考文献[略]

本文译Science Direct 
原文作者MustaphaBerri​、 MichelOlivier、SébastienHolbert
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